Gran avance en la microscopía de fluorescencia de superresolución

Los científicos dirigidos por el premio Nobel Stefan Hell en el Instituto Max Planck de Investigación Médica en Heidelberg han desarrollado un microscopio de súper resolución con una precisión espaciotemporal de un nanómetro por milisegundo. Una versión mejorada de su microscopía de súper resolución MINFLUX recientemente presentada ha hecho posible observar pequeños movimientos de proteínas únicas con un detalle sin precedentes: el movimiento escalonado de la proteína motora kinesina-1 mientras camina a lo largo de los microtúbulos mientras consume ATP. El libro, publicado en Cienciadestaca el poder de MINFLUX como una nueva herramienta revolucionaria para observar cambios conformacionales a nanoescala en proteínas.

Para desentrañar el funcionamiento interno de una célula, se debe conocer la bioquímica de las proteínas individuales. Medir pequeños cambios en su posición y forma es el desafío central aquí. La microscopía de fluorescencia, en particular la microscopía de súper resolución (es decir, la nanoscopía), se ha vuelto indispensable en este campo emergente. MINFLUX, el sistema de nanoscopia de fluorescencia recientemente presentado, ya ha logrado una resolución espacial de uno a unos pocos nanómetros, el tamaño de pequeñas moléculas orgánicas. Pero llevar nuestra comprensión de la fisiología molecular de las células al siguiente nivel requiere observaciones con una resolución espaciotemporal aún mayor.

Cuando el grupo de Stefan Hell introdujo por primera vez MINFLUX en 2016, se utilizó para rastrear proteínas marcadas con fluorescencia en las células. Sin embargo, estos movimientos eran aleatorios y el seguimiento tenía precisiones del orden de diez nanómetros. Su estudio es el primero en aplicar el poder de resolución de MINFLUX a los cambios conformacionales en las proteínas, en particular, la proteína motora kinesin-1. Para hacer esto, los investigadores del Instituto Max Planck de Investigación Médica han desarrollado una nueva versión de MINFLUX para rastrear moléculas fluorescentes individuales.

Todos los métodos establecidos para medir la dinámica de proteínas tienen serias limitaciones, que dificultan su capacidad para abordar el rango de (sub) nanómetros/(sub) milisegundos de importancia crítica. Algunos ofrecen una alta resolución espacial, de unos pocos nanómetros, pero no pueden rastrear los cambios lo suficientemente rápido. Otros tienen una alta resolución temporal pero requieren el etiquetado con perlas de 2 a 3 órdenes de magnitud más grandes que la proteína en estudio. Dado que es probable que el funcionamiento de la proteína se vea comprometido por una perla de este tamaño, los estudios que utilizan perlas dejan preguntas abiertas.

Fluorescencia de una sola molécula

Sin embargo, MINFLUX solo requiere una molécula de fluorescencia estándar de 1 nm como etiqueta adherida a la proteína y, por lo tanto, puede proporcionar tanto la resolución como la invasividad mínima necesarias para estudiar la dinámica de la proteína nativa. «Uno de los desafíos es construir un microscopio MINFLUX que opere cerca del límite teórico y esté protegido del ruido ambiental», dice Otto Wolff, estudiante de doctorado en el grupo. «Diseñar sondas que no afecten la función de la proteína, pero que revelen el mecanismo biológico, es otra», agrega su colega Lukas Scheiderer.

El microscopio MINFLUX que ahora muestran los investigadores puede registrar movimientos de proteínas con una precisión espaciotemporal de hasta 1,7 nanómetros por milisegundo. Requiere la detección de solo veinte fotones emitidos por la molécula fluorescente. “Creo que estamos abriendo un nuevo capítulo en el estudio de la dinámica de las proteínas individuales y cómo cambian de forma durante su funcionamiento”, dice Stefan Hell. «La combinación de alta resolución espacial y temporal proporcionada por MINFLUX permitirá a los investigadores estudiar biomoléculas como nunca antes».

Resolviendo Kinesin-1 Step Motion con ATP bajo condiciones fisiológicas

Kinesin-1 es un jugador clave en el transporte de mercancías en nuestras células, y las mutaciones en la proteína están en el corazón de varias enfermedades. Kinesin-1 en realidad «camina» a lo largo de los filamentos (microtúbulos) que recorren nuestras células como una red de calles. Uno puede imaginar que el movimiento es literalmente un «paso a paso», ya que la proteína tiene dos «cabezas» que cambian alternativamente de ubicación en los microtúbulos. Este movimiento generalmente ocurre a lo largo de uno de los 13 protofilamentos que forman el microtúbulo y es impulsado por la descomposición del principal proveedor de energía de la célula, ATP (trifosfato de adenosina).

Usando un solo fluoróforo para etiquetar la kinesina-1, los científicos registraron los pasos regulares de 16 nm de las cabezas individuales, así como los subpasos de 8 nm, con una resolución espaciotemporal de nanómetros/milisegundos. Sus resultados demostraron que el ATP se absorbe cuando solo una cabeza está unida al microtúbulo, pero la hidrólisis de ATP ocurre cuando ambas cabezas están unidas. También reveló que el paso implica rotar el «tallo» de la proteína, la parte de la molécula de cinesina que contiene la carga. La resolución espacio-temporal de MINFLUX también reveló la rotación de la cabeza en la fase inicial de cada paso. Significativamente, estos descubrimientos se realizaron utilizando concentraciones fisiológicas de ATP, algo que hasta ahora no era posible con pequeños marcadores fluorescentes.

«Estoy emocionada, así que veamos adónde nos lleva MINFLUX. Agrega otra dimensión al estudio de cómo funcionan las proteínas. Puede ayudarnos a comprender los mecanismos detrás de muchas enfermedades y, en última instancia, ayudar a desarrollar terapias», agrega Jessica Matthias, científica postdoctoral anteriormente en el grupo Hell. quien ahora está explorando aplicaciones de MINFLUX a una variedad de preguntas biológicas.