Los patrones de iluminación de rejilla óptica ayudan con la resolución axial y la sección óptica
En un estudio reciente publicado en Naturaleza Comunicación, un equipo de investigadores evaluó las variaciones entre las láminas de luz gaussianas y de rejilla relacionadas con la homogeneidad del haz, la precisión axial, la resolución transversal y el fotoblanqueo mediante cálculos y mediciones experimentales en celdas fijas.
Estudiar: Un análisis cuantitativo de varios modelos aplicados en microscopía de lámina de luz de matriz. Haber de imagen: Micha Weber/Shutterstock.com
Los investigadores han demostrado que se pueden ajustar diferentes patrones de iluminación de rejillas ópticas para resaltar la precisión axial o el corte visual. También presentaron un método para obtener imágenes de alta resolución y bajo ruido mediante la fusión espectral de adquisiciones sucesivas de varios patrones de láminas de luz de rejilla con las características ópticas correspondientes.
Potencial de los microscopios de láminas de luz
Las imágenes de materiales biológicos de varios tamaños, que van desde átomos individuales hasta organismos completos, se obtienen mediante microscopía de lámina de luz.
Los microscopios de lámina de luz mejoran la velocidad de obtención de imágenes y reducen la fototoxicidad. Solo un plano delgado de la muestra se ilumina durante la microscopía de hoja de luz. Esto elimina la iluminación nebulosa, disminuye el fotoblanqueo y mejora la relación señal-ruido (SNR) en comparación con la epifluorescencia y la microscopía óptica.
Limitaciones de los microscopios de lámina de luz
La resolución axial de un microscopio de lámina de luz y el campo de visión visible son inversamente proporcionales cuando están equipados con haces gaussianos. Al adoptar patrones de iluminación estructurados axialmente, las láminas de luz dependientes de la rejilla brindan una mejor resolución axial y homogeneidad del haz que los haces gaussianos. Estas ventajas se obtienen a expensas de que la muestra absorba más luz y el patrón de iluminación esté menos restringido axialmente.
Usando lentes cilíndricas, las técnicas de microscopía de láminas de luz más eficientes enfocan un haz gaussiano en una lámina estirada lateralmente. Este enfoque tiene una compensación inherente entre la longitud de propagación y el espesor de la hoja ligera. Se ofrece una mayor sección transversal óptica y resolución axial mediante el uso de láminas de luz gaussianas más delgadas, pero a expensas de una longitud de propagación más corta y un campo de visión más estrecho.
Estrategias para mejorar la resolución axial y el seccionamiento óptico en microscopios de lámina ligera
Las láminas de luz estructuradas, como los haces de Bessel y las rejillas ópticas, se pueden utilizar para superar las limitaciones de los microscopios de lámina de luz.
Los haces híbridos compuestos por haces no difractantes y gaussianos se pueden producir con el patrón de iluminación restringido a un solo plano.
Según los objetivos de la imagen, el usuario puede ajustar el patrón de iluminación para mejorar la longitud de propagación, la sección óptica o la resolución axial variando el ancho de la envolvente de atenuación en la muestra.
Evaluación de patrones de iluminación de rejillas ópticas para mejorar la resolución axial y la sección óptica
Las rejillas ópticas tienen tamaños de haz y funciones de transferencia óptica (OTF) idénticos a los de los haces gaussianos. Las prestaciones de los equipos que utilizan rejillas ópticas cuadradas y haces gaussianos enfocados son idénticas.
Shi y otros. evaluó e informó las ventajas y desventajas de las láminas de luz de celosía frente a los haces gaussianos. Hicieron observaciones reales sobre perlas de difracción limitada, arquitecturas celulares y modelos ópticos. Los investigadores demostraron cómo se pueden modificar las hojas de luz estructuradas para que funcionen de manera similar a un sistema gaussiano ajustando la envolvente delimitadora en el nivel de la muestra.
Shi et al. evaluó OTF y la correlación del plano de Fourier (FPC) para analizar las relaciones de frecuencia espacial en imágenes en varios puntos a lo largo de la longitud de propagación del haz. También estudiaron hojas de luz con longitudes de propagación similares.
Resultados de la búsqueda
En esta investigación, se examinaron las ventajas y desventajas de varios patrones de haz utilizados en la microscopía de láminas de luz utilizando modelos de simulación y observaciones prácticas. Se utilizaron comparaciones de FWHM en espacio real, comparaciones de OTF en espacio de frecuencia y FPC para evaluar el rendimiento del haz al obtener imágenes de diferentes estructuras subcelulares en células vivas y fijas a diferentes densidades de transmisor y relaciones señal-ruido.
En comparación con los haces gaussianos o de punta plana, los haces de celosía cuadrada y hexagonal los han superado constantemente en resolución axial y homogeneidad del haz a lo largo de la ruta de propagación.
Al ajustar los haces de rejilla para que sean más gaussianos, se pueden adaptar diferentes patrones de rejilla a ciertos escenarios de imágenes. Las desventajas de los haces de rejilla hexagonales, cuadrados y de parte superior plana en comparación con los haces gaussianos incluyen una mayor excitación fuera del plano y una sección transversal óptica reducida. Esto produce una pérdida de resolución lateral y un aumento del fotoblanqueo en especímenes vivos y muestras fluorescentes al aumentar el ruido de disparo debido al desenfoque del fondo.
En aplicaciones donde la resolución axial y el cumplimiento son menos críticos que el fotoblanqueo, se debe preferir un haz gaussiano a haces de celosía planos o hexagonales de la misma longitud de propagación e intensidad máxima. Si la resolución axial y la conformidad del haz son importantes, se deben utilizar rejillas hexagonales. Se pueden usar diferentes láminas de luz de rejilla para equilibrar estos parámetros de acuerdo con las necesidades experimentales.
Referencia
Shi, Y., Daugird, TA y Legant, WR (2022). Un análisis cuantitativo de varios modelos aplicados en microscopía de lámina de luz de matriz. Naturaleza Comunicación, 13(1), 4607. https://www.nature.com/articles/s41467-022-32341-w
